猫爪草有效成分小毛茛靶细胞PBL以及颗粒裂解肽基因表达的作用
（一）材料和方法
1.靶细胞PBL（周围血淋巴细胞）采集
试验对象分4组，每组28人。
①18~30岁健康志愿者:有卡介苗接种史并有接种卡痕，PPD皮试＜15mm；X线胸片正常；血PPD-IgG,PPD-IgM阴性。
②成年人经X线胸片和（或）痰培养初诊为肺结核，抽血标本前未经抗结核化疗。
③成年人经痰培养阳性确诊为肺结核，已完成至少1个疗程以上的全程联合化疗后，药敏试验示结核杆菌至少对异烟肼或利福平耐药者；痰培养未转阴者。
④2~14岁儿童经X线胸片和PPD皮试≥15mm和（或）PPD-IgG、PPD-IgM阳性、和（或）有TB接触史和反复呼吸道感染病史。
实验用药物：小毛茛内酯（ternatolide，Tern.）是从猫爪草块根中分离提取的一种δ-内酯类化合物，为白色针状晶，分子式为C5H6O3。
2.PBL细胞的获得、体外培养和活化
以上4组人群每组随机分为7种体外培养组合，方案见表4-1。
抽取外周静脉血5~10ml，肝素抗凝，用Ficoll-hypaque（pharmaciaotech，Uppsala，Swe-den）分离PBL,用RPMI完全培养液，调整细胞浓度至1x/ml，按表4-1设计加入相应的活化诱导剂；37℃，5%CO2培养72h后高速低温离心，沉淀细胞做总RNA提取。3.QC-RT-PCR检测GLSmRNA的表达
（1）主要试验和仪器
M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA多聚酶、dNTPs，Oli-godT引物（promega）、THermojetEquiBioDNA扩增仪、凝胶分析系统（PCgene公司）。
（1）方法与步骤
①总RNA的提取：用TrizolPNA快速抽提试剂提取以上4组7个组合各样本靶细胞总RNA，常规测定总RNA的浓度，A/比值均在1.8~2.0，-70℃贮存。
②引物：引物设计根据文献，引物序列为：颗粒裂解肽（GLS）senseGGGGAAGCTCCATAAATGTCACCTAntisenseTACACACAAGAGGGCCTCCAGAT;GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶，内参对照）SenseGGTGAAGGTGTCAACG,Anti-senseCAAAGT-TCGCATGGATGACC。
③RT:以2μg总PNA为模板进行反转录，在20μl反转录反应体积中加入2μl总RNA，M-MuLV酶0.5μl（10xU/L），1μlOligdT(μlU/L)，0.7μlRNasin（30xU/L），2μl10mmol/LdNTP，稀释5倍的RT缓冲液（5xRTbuffer），加DEPC-H2O至20μl37℃反应1h，灭活反转录酶后，以2μl合成的cDHA第一链为模板进行PCR。
④PCR反应：在50μlPCR反应体系中分别加入2μlcDNA产物，稀释10倍的PCR缓冲液（10xPCRbuffer）5μl，0.5UTaqDNA聚合酶（5xU/L）1μl相应GLS引物P1P2(或GAPDH引物P1P2各1μl）反应参数为94℃1min，55℃30s，72℃30s,72℃7min延伸，共进行35个循环。为了控制每次RNA提取和PCR循环中的差异，每一样本体系同时扩增GLS和GAPDH的cDNA,产物分别为bp和bp的两条片段。PCR产物于2%琼酯糖凝胶电泳。
⑤PCR产物半定量分析：电泳产物经EB染色后照相；并用凝胶图像扫描仪测两电泳带光密度值，计算每一样品GLS与其内参对照GAPDH比值的相对含量，单位用皮克/微升（pg/μl）表示。
4.统计学分析
实验结果用表示，Spss9.0统计软件的t检验比较组间的差异，多组之间用F分析。
（二）结果
1.Tern对PBL体外活化后GLSmRNA表达的QC-RT-PCR测定结果
体外培养前组和RPMI完全培养液组未见明显的电泳条带，PHA和Tern活化组在bp处均可见一清晰的电泳带，与预期的GLS基因片段长度相符。同时，在bp处亦可见一内参GAPDHmRNA的扩增产物电泳带，说明GLSmRNA扩增结果的可靠性。
2.Tern对健康成年人PBL体外培养GLSmRNA表达的作用
健康人组的28例PBL标本成份均按表4-2的方案进行培养观察，未加任何受试化合物（对照组）培养72h后PBL颗粒裂解肽几乎不表达，与RPMI培养组PBL颗粒裂解肽表达几乎接近，两者差异无显著性。单加入Tern或加入PHA+Tern后培养PBL颗粒裂解肽表达产物的半定量分析结果显示：其两组的GLSmRNA表达水平均明显高于对照组，与对照组相比其差别均在统计学上有显著性。（p＜0.01，p＜0.01），单加入TernGLSmRNA的表达水平偏低，与PHA组、PHA+Tern组表达产物两两分别比较亦有显著性差别（p＜0.01，p＜0.01）见表4-2。说明Tern在所用剂量时具有诱导体外活化的PBLGLS基因表达的作用。
3.不同剂量的Tern对健康人和结核病人PBL体外GLSmRNA表达的作用
PBL在PHA体外活化后当Tern浓度为50mg/L时，GLSmRNA表达水平：健康人为0.02±0.，结核病人为0.±0.06；与对照组比较，差异无显著性（p＞0.05），当Tern浓度分别增加到为mg/L,mg/L时，GLSmRNA表达水平分别为健康人0.±0.04，结核病人0.±0.；健康人±0.±0.，结核病人0.±0.03，与对照组比较，差异有显著性（p＜0.01）；Tern不同浓度第6组，第7组GLSmRNA的表达水平与单用PHA体外活化组（第3组）的表达水平比较，第6，第7组明显高于第3组。（p＜0.01）实验结果显示，低剂量的Tern不能诱导健康人和结核病人的PBLGLSmRNA表达的作用，这种诱导作用在健康人群和结核病人组差异无显著性（p＞0.05）。
4.Tern对不同类型结核病人PBL体外GLSmRNA表达的影响
当Tern浓度为mg/L时，对未治疗初诊肺结核病人，耐药型TB病人，儿童I型肺结核患儿PBL体外GLSmRNA水平的表达与对照组比较具有显著差异（结果见表4-3）。但3组完全随机设计的方差分析，F=0.11无显著意义，说明Tern在有效浓度时诱导免疫功能低下的耐药肺结核病人和儿童结核病人体外PBL颗粒裂解肽基因表达水平与未治疗肺TB病人的表达水平相比，差异无显著性。
颗粒裂解肽，又称颗粒溶素，原称为（granulysin，GLS）是在细胞毒性淋巴细胞（cyto-toxiclymphocyte，CTL）和天然杀伤细胞（naturalkillercells，NK）激活晚期被诱导表达的一种多肽具有广谱抗菌活性，尤其是能杀死结核菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB），GLS基因表达水平的高低是CTL抗MTB功能的反映。因此，GLS基因表达水平的高低是CTL杀灭胞内细菌分子效能的指标之一。本研究采用反转录聚合酶链反应半定量（QC-RT-PCR）方法，测定不同剂量的猫爪草有效成分Tern对4组人群（健康成年人，初诊未治、耐药肺结核病人及儿童结核患儿）的周围血淋巴细胞（PBL）体外活化后颗粒裂解肽（GLS）mRNA表达水平的影响，探讨了Tern抗结核菌作用的分子免疫学机制。
结果显示，Tern能诱导健康人群、结核患者体外活化后的PBLGLS高水平的表达，其表达产物与对照组比较差异有显著性，但在此两种人群中的表达水平差异无显著性。Tern对GLSmRNA的诱导作用呈现剂量依赖性，当Tern浓度达到mg/L以上时，这种诱导影响方有显著性差异，Tern诱导GLSmRNA表达的另一个特点是：Tern在有效浓度时对免疫功能低下的耐药肺结核病人和儿童结核病人GLSmRNA的诱导表达水平与未治疗的肺结核病人和健康人群的诱导表达水平差异无显著性。以上这些结果均提示，Tern可能是通过提高CTL的效应分子GLSmRNA的表达水平，活化CD8+细胞，促进其以颗粒依赖的方式裂解惑染了MTB的M?，杀灭胞内致病菌MIB,因而对休眠菌感染亦显示出抗菌作用。Tern可望作为一种新型的内源性抗生素颗粒裂解肽的诱导剂，治疗耐药、多耐药结核病。
猫爪草胶囊
猫爪草。
本品为胶囊剂，内容物为棕褐色光滑小丸粒；气微，味微酸。
散结，消肿。用于瘰疬，淋巴结核未溃者，亦可用于肺结核。
每粒装0.53g。
口服，一次4-6粒，一日3次，黄酒送服。连服六日，隔三日后再服。老人及儿童酌减。（儿童用快接健冲温开水送服，3至4岁一次1粒，5至8岁一次2粒，9至12岁一次3粒，每日3次；女士避开经期。）
尚不明确。
尚不明确。
乳腺增生，子宫肌瘤，前列腺炎、增生、肥大，甲状腺结节，囊肿，淋巴结肿大，肿瘤，结核，宫颈糜烂，糖尿病，顽固性牙痛，偏头痛，肝病等。
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